Open Access
Issue
BIO Web Conf.
Volume 9, 2017
40th World Congress of Vine and Wine
Article Number 02018
Number of page(s) 5
Section Oenology
DOI https://doi.org/10.1051/bioconf/20170902018
Published online 04 July 2017

© The Authors, published by EDP Sciences 2017

Licence Creative Commons
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1 Cytométrie en flux : vue d’ensemble et principe

La cytométrie en flux (CMF) est considérée comme une étude de cellules isolées dans un flux. La CMF est une technique robuste pour analyser des paramètres multiples de cellules individuelles au sein d’un ensemble hétérogène de microorganismes par exemple. Plusieurs revues et livres ont été publiés traitant du principe de cytométrie en flux et donnant de nombreux détails [13].

Brièvement, un cytomètre en flux est composé de trois principaux systèmes : fluidique, optique et électronique (Fig. 1).

thumbnail Figure 1.

Schéma du principe d’un cytomètre en flux.

Le système fluidique permet de séparer et d’aligner les particules grâce au liquide de gaine (focalisation hydrodynamique) [1]. Une fois alignées, les particules passent devant un ou plusieurs lasers.

La lumière émise par les cellules, suite à leur irradiation à l’intérieur de la chambre de flux, est dirigée vers les détecteurs par un système complexe de miroirs et filtres qui composent le système optique. La lumière émise aux petits angles est détectée (FSC). Cette mesure est proportionnelle à la taille des cellules. La lumière est également détectée aux grands angles (SSC). Cette dernière est proportionnelle à la complexité à l’intérieur de la cellule ainsi qu’à la granulosité cellulaire. Un autre dispositif est utilisé pour détecter le rayon lumineux à travers un ensemble de filtres séparant la lumière selon la longueur d’onde (filtres de fluorescences).

La lumière passant par le système optique est convertie en signaux électroniques générés par des photodiodes et des tubes photomultiplicateurs (PMT) puis collectés. De récents cytomètres en flux peuvent avoir jusqu’à 12 PMT et ce nombre ne cesse d’augmenter avec le développement des nouvelles technologies (détection spectrale).

Contexte

Le vin est une matrice complexe contenant de nombreux composés et microorganismes tels que des levures, des bactéries lactiques (BL) et acétiques (BA). Lors de l’élaboration du vin, il est indispensable de connaitre les populations réalisant les fermentations mais également la concentration des microorganismes d’altération présents afin d’avoir une bonne qualité finale. Différentes techniques sont disponibles afin de détecter et/ou quantifier ces microorganismes durant les étapes de fermentation et dans le vin produit.

À ce jour, les laboratoires œ nologiques utilisent différentes techniques permettant ces détections et quantifications. Premièrement, l’utilisation de boites de Pétri sélectives permet d’énumérer les microorganismes cultivables présents dans l’échantillon. Cependant la formation de colonies demande des temps d’incubation long (généralement entre 2 et 10 jours) selon les microorganismes. De plus cette méthode ne permet pas la quantification des microorganismes en état viable mais non cultivable (VNC), retrouvés couramment en vin [48].

La quantification par microscopie utilisant les cellules de Thoma ou Malassez est une autre méthode, mais celle-ci est longue, fastidieuse, subjective et avec une limite de quantification d’environ 104 cellules/mL. Néanmoins, couplée à l’utilisation de marqueurs fluorescents, la microscopie permet de déterminer des fonctions cellulaires spécifiques ou d’identifier les microorganismes présents avec l’utilisation de sondes spécifiques fluorescentes par exemple (Direct Epifluorescence Filter Technique).

D’autres techniques basées sur la réaction en chaine par polymérase (PCR), comme la PCR quantitative peut également permettre de détecter et quantifier les microorganismes. En effet, par l’utilisation d’amorces capables de se fixer spécifiquement à des séquences cibles d’ADN et l’utilisation d’un intercalant d’ADN (SybrGreen par exemple) ou de sondes spécifiques fluorescentes (sondes TaqMan par exemple), cette technique permet une quantification précise des microorganismes présents. Cependant, cette méthode demande une étape d’extraction d’ADN avant de réaliser la PCR. Celle-ci peut être perturbée par la composition du vin, spécifiquement pour les vins rouges contenant une importante quantité de polyphénols. Ces molécules peuvent s’adsorber au niveau de la paroi cellulaire [9, 10] influençant la lyse cellulaire durant l’extraction de l’ADN et pouvant conduire à un faible rendement d’extraction. De plus, un problème lors de l’amplification de l’ADN peut également intervenir par la présence de composés inhibiteurs tels que les tannins, polysaccharides et pigments [11, 12].

La méthode CMF permet à la fois une détection et une quantification des microorganismes avec rapidité et une forte spécificité. Premièrement, la CMF permet de suivre l’état physiologique des cellules durant la fermentation alcoolique (FA) ou malolactique (FML). De plus, la CMF peut être utilisée plus spécifiquement, c’est-à-dire couplée à la méthode d’hybridation d’une sonde in situ en fluorescence (FISH) afin de quantifier certains microorganismes d’altération par exemple. Dans l’optique d’augmenter voire de généraliser l’utilisation de la CMF appliquée au vin, cet article a pour but de référencer les différentes applications utilisées et envisageables de cette technique en œ nologie.

2 Quantification et analyse de l’état physiologique des microorganismes œ nologiques par CMF

L’énumération des bactéries et des levures peut être effectuée par CMF (Fig. 2) sans l’utilisation de marqueurs en milieu de culture et certains vins blancs.

thumbnail Figure 2.

Discrimination des bactéries et des levures par CMF (FSC : taille; SSC : granulosité) (donnée personnelle).

Selon le vin étudié, spécifiquement pour le vin rouge, l’énumération peut être plus difficile par la présence d’une concentration importante de composés détectée par le cytomètre en flux, confondu avec les bactéries et même parfois avec les levures. À ce jour, plusieurs marqueurs fluorescents comme les marqueurs SYTO, non fluorescents jusqu’à leur liaison avec l’ADN, sont disponibles. Le DAPI et les marqueurs SYBR sont également utilisés. Ceux-ci présentent une fluorescence plus importante lorsqu’ils sont liés à l’ADN.

2.1 Vitalité cellulaire

Afin de réaliser les fermentations durant l’élaboration du vin, les levures et bactéries doivent être en vie et métaboliquement active. Les marqueurs de vitalité permettent de déterminer les fonctions essentielles vitales comme l’activité enzymatique par exemple. La fluorescéine di-acétate (FDA) est un marqueur couramment utilisé dans de nombreuses applications puisque son utilisation est rapide et simple [13] (Figure 3). En effet, le marquage FDA reflète l’activité enzymatique cellulaire à travers l’activité estérase, mettant en évidence l’activité métabolique cellulaire.

thumbnail Figure 3.

Autofluorescence (histogramme noir) et fluorescence aprés marquage avec le FDA (histogramme rouge) d’une population de levures lors d’un passage au cytométre en flux. (donnée personnelle).

2.1.1 Levures

Ainsi une bonne corrélation entre boites de Pétri et CMF avec marquage FDA pour l’énumération de Saccharomyces cerevisiae a été mise en évidence [14]. Le carboxy-FDA (cFDA) peut également être utilisé car la fluorescéine carboxylée présente une meilleure rétention au sein de la cellule. Le marqueur FUN-1 [7] permet également d’analyser la vitalité cellulaire. Celui-ci pénètre dans les cellules et entraine une fluorescence verte du cytoplasme. Lorsque les levures sont actives métaboliquement, des structures intra-vacuolaires cylindriques se forment et présentent une fluorescence rouge.

2.1.2 Bactéries

Concernant les bactéries, une quantification de O. oeni en vin rouge durant la FML a été menée par dénombrement classique (boites de Pétri) et CMF en testant 4 marqueurs différents : Rhodamine 123; Calcein acétoxyméthyl ester (Calcein-AM); 2′, 7′-bis-carboxyethyl -5(6)- carboxyfluorescéine acétoxyméthyl ester (BCECF-AM) et FDA [14]. Des différences d’intensité de fluorescence selon les marqueurs et les souches testées ont été mises en évidence. La majorité des souches étaient marquées avec la FDA. Cependant, 40% des O. oeni sont fluorescentes après 10–15 min, 30% après 60 min, et deux souches ne sont pas marquées, traduisant probablement une fuite de la fluorescéine vers le tampon à travers la membrane entrainant ainsi une perte de fluorescence des cellules. Ce problème conduit à une différence significative lors de l’énumération de O. oeni en vin Bardolino entre les boites de Pétri et la CMF. En vin blanc, la quantification semble possible avec la FDA [15]. Cependant, une autre étude a mise en évidence une faible corrélation entre les boites de Pétri et la CMF en utilisant la FDA lors de la phase de latence et en fin de croissance en milieu de culture [4].

Pour le marquage FDA, il est important de rappeler que les estérases intracellulaires présentent une activité maximum à pH 7,6, à 30 °C après une incubation de 20 min.

En vin rouge, différents marqueurs de vitalité ont été testés mais aucun ne s’est montré satisfaisant afin de quantifier la vitalité bactérienne au cours de la FML.

2.2 Viabilité cellulaire

Les marqueurs de viabilité déterminent si les cellules sont dans un état physiologique permettant leur survie, comme la mesure de la perméabilité membranaire. L’iodure de propidium (IP) est fréquemment utilisé comme marqueur d’intégrité membranaire [16]. L’IP rentre dans les cellules perméables et se fixe à l’ADN. Les cellules présentent alors une fluorescence rouge. Cependant, l’utilisation de ce marqueur présente un important désavantage. Différents stress comme l’éthanol sont connus pour entrainer une augmentation de la perméabilité membranaire [17] et donc biaiser le résultat, voire rendre fluorescente des cellules vivantes [18].

2.2.1 Levures

Différentes études ont utilisé l’IP pour suivre la sédimentation cellulaire [19] et suivre la population levurienne durant la FA en moût synthétique [6, 16, 20]. De bonnes corrélations ont été mises en évidence. D’autres études ont été effectuées en moûts blanc et rouge [21, 22]. Une sous population a été révélée, appelée « population fragile » qui présentait une perméabilité durant la FA mais cet état était réversible.

2.2.2 Bactéries

La quantification de O. oeni a été menée durant la FML. La discrimination entre les bactéries vivantes et mortes en vin rouge est parfois impossible, liée à la présence de débris en grande quantité. Une étude a toutefois démontré que cette quantification était possible par un double marquage [15]. Ces marqueurs, comme ceux cités précédemment, sont non spécifiques, c’est-à-dire que si l’échantillon contient différentes bactéries, il n’est pas possible d’affiner l’analyse à une sous population. Cependant, lors de la FML, il est très probable que cette quantification soit majoritairement celle de bactéries lactiques, voire exclusivement O. oeni.

2.3 Double marquage vitalité / viabilité

2.3.1 Levures

Le suivi de la FA de cidres a été réalisé en utilisant les marqueurs CV6, IP et DRAQ5 afin de quantifier la vitalité, la viabilité et la population totale présente. Des cellules doublement marquées ont été ainsi détectées (fonction vitale active mais avec une importante perméabilité membranaire) [23]. Ces résultats ont ensuite été confirmé dans une autre étude [24].

2.3.2 Bactéries

L’analyse de la rétention de la carboxy-fluorescéine ainsi que l’exclusion de l’IP a été réalisée pour O. oeni adaptée ou non à l’éthanol en milieu de culture [25]. Les mesures de fluorescence ont été menées suite à un stress éthanol 16% (v/v) ou sans stress. Les résultats ne montrent aucune différence significative entre les fluorescences en l’absence de stress alors que suite à l’application du stress éthanol, la fluorescence de la fluorescéine diminue de 25% et celle de l’IP augmente de 80%. En revanche, lorsque les cellules sont préalablement adaptées à l’éthanol, le stress éthanol 16% (v/v) entraine un impact cellulaire moins important. Des doubles marquages ont également été réalisés lors d’un suivi de FML [26]. Cependant, dans une étude [25] ils ont démontré que l’intensité de fluorescence augmente entre 15 min et 60 min contrairement à une étude précédente [14]. Il est donc important d’avoir connaissance de ces potentiels biais qui peuvent intervenir lors d’analyses d’échantillons issus du vin.

2.4 Etat viable mais non cultivable (VNC)

La technique de CMF permet également de mettre en évidence l’état VNC en utilisant un marqueur de vitalité ainsi que le dénombrement sur boites de Pétri.

2.4.1 Levures

Par CMF, le SO 2 a été décrit comme un facteur conduisant à l’entrée en état VNC pour Brettanomyces bruxellensis [8] et S. cerevisiae [7, 27]. Les marqueurs de vitalité sont actifs alors qu’aucune colonie n’est détectée sur milieu sélectif.

2.4.2 Bactéries

Ce même état VNC a été observé chez O. oeni par CMF lors de la FML dans un milieu caractérisé par un faible pH, en présence d’éthanol et un déficit en nutriments [23].

2.5 Autres applications

Bien que l’utilisation des marqueurs de viabilité et vitalité soient les principaux utilisés afin de suivre la FA ou la FML dans différentes matrices, d’autres marqueurs fluorescents existent et permettent d’obtenir des informations supplémentaires sur l’état physiologique des cellules.

L’analyse du cycle cellulaire, le potentiel membranaire, la présence d’espèces réactives à l’oxygène, la concentration en lipides intracellulaires, le pH intracellulaire peut être ainsi mesuré [13].

3 Enumeration spécifique des microorganismes du vin

3.1 Utilisation des anticorps spécifiques

L’utilisation d’anticorps spécifiques permet de quantifier spécifiquement S. cerevisiae en moût [28]. Afin de réaliser le marquage, une incubation du moût en fermentation avec un premier anticorps polyclonal anti- Saccharomyces est effectuée puis un second anticorps couplé à un fluorochrome est utilisé. Il est également possible de suivre la population de O. oeni réalisant la FML en même temps que la FA en moût de Chardonnay [28]. Cette méthode a également été développée afin de quantifier B. bruxellensis en vin rouge lors de l’élevage [29].

3.2 Utilisation d’une sonde oligonucléotidique

La technique d’hybridation in situ en fluorescence (FISH) peut être couplée à la CMF. La FISH est utilisée depuis de nombreuses années [30] mais la visualisation de la fluorescence était principalement effectuée par microscopie avant d’être combinée à la CMF il y a une dizaine d’années [31]. Aujourd’hui, de nombreuses espèces présentent en œ nologie peuvent être discriminées au sein d’une population globale par l’utilisation d’une sonde oligonucléotidique [13]. B. bruxellensis est une levure dont une quantification précise et rapide est indispensable lors de l’élevage de vin rouge. Plusieurs études se sont donc intéressées à développer une sonde spécifique pour ensuite être appliquée à la CMF [32, 33].

4 Futures applications

Comme la microscopie, la CMF est également utilisée dans de nombreux domaines. C’est pourquoi de nombreuses applications sont envisageables en œ nologie.

L’utilisation d’un marqueur fluorescent spécifique tel que le 1,6-Diphenyl-1,3,5-hexatriene (DPH) [34] permettrait d’avoir une information sur la fluidité membranaire des levures et des bactéries en vin, et donc sur leur état physiologique à un instant donné.

L’utilisation de sondes peptidiques (PNA) fluorescentes, non chargées donc plus aptes à pénétrer au sein de la cellule, pourrait permettre la quantification spécifique d’une sous population. Des sondes permettant de quantifier les principales bactéries lactiques du vin sont également connues et pourraient être appliquées.

5 Conclusions

La cytométrie en flux est à ce jour encore peu utilisée dans le domaine de l’œ nologie. Cependant, de plus en plus d’études sont réalisées afin de développer des outils simples, rapides, fiables avec un faible coût afin de répondre aux différents besoins des vignerons. La matrice vin est très complexe, c’est donc pour cela que la plupart des protocoles développés dans d’autres matrices ne sont pas directement applicables aux échantillons du chai. C’est pourquoi il est nécessaire de mener d’autres études qui conduiront, à terme, à rendre la CMF indispensable lors d’une analyse microbiologique en œ nologie.

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Liste des figures

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Schéma du principe d’un cytomètre en flux.

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Discrimination des bactéries et des levures par CMF (FSC : taille; SSC : granulosité) (donnée personnelle).

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Autofluorescence (histogramme noir) et fluorescence aprés marquage avec le FDA (histogramme rouge) d’une population de levures lors d’un passage au cytométre en flux. (donnée personnelle).

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