© The Authors, published by EDP Sciences 2017

1 Introducción

Las poblaciones de vid silvestre euroasiática se extienden desde la región caucásica pasando por la cuenca del Mediterráneo (Turqua, Grecia, Italia, Sur de Francia y Pennsula Ibérica) hasta el macizo del Hindu Kush (Afganistán y Pakistán) y el Magreb (Marruecos, Túnez y Argelia). Sus ejemplares pertenecen al taxón Vitis vinifera L. subespecie sylvestris Gmelin (Hegi), única especie ancestral en Europa y son parentales dioicos de las variedades de cultivo. Estas últimas son fundamentalmente hermafroditas, aunque pueden encontrarse también ejemplares femeninos, como ocurre en la región Caucásica [1]. La Pennsula Ibérica e Itálica constituyen hoy en da uno de los principales refugios para esta subespecie durante la última glaciación. En España existen pruebas palinológicas del Pleistoceno medio en las turberas de El Padul (Granada), y en la Laguna de Las Madres (Huelva) [2, 3].

Según las referencias de Rivera y Walker [4], dentro de la Pennsula Ibérica, las bayas de vid silvestre han contribuido directamente a la alimentación humana desde el Paleoltico. Las plantas domesticadas por el hombre son aquéllas que le sirven para su dieta o son aplicables a sus actividades cotidianas, entre ellas se encontraba esta liana. A partir de los escasos ejemplares hermafroditas aparecidos en la naturaleza como resultado de mutación, se fueron seleccionando variedades de cultivo [5]. Un estudio publicado en 2006 que lleva a cabo los diversos clorotipos y su distribución en 1201 muestras de muy diverso material silvestre y cultivado, procedente de diferentes áreas de la Pennsula Ibérica, Itálica, Oriente Medio y Norte de África refuerza la teora del origen policéntrico de la domesticación de la vid [6]. El artculo señala, además, que el 70% de los viñedos de la Pennsula Ibérica e Itálica exhiben clorotipos derivados de las poblaciones silvestres de Europa Occidental, por lo que sostiene la idea sobre la existencia de una región de refugio para la vid, entre otras especies botánicas, en la Pennsula Ibérica y cuyos genes son completamente distintos de las variedades cultivadas. Parece ser que el proceso de domesticación fue acelerado y guiado en primer lugar por la influencia cultural, y después, por las aportaciones directas de las actividades que realizaron los colonos fenicios, griegos y púnicos en la cuenca del Mediterráneo occidental. Se puede pensar, por lo tanto, que en las zonas de distribución de la vid silvestre, la introducción en primer lugar del consumo del vino y, posteriormente, de la viticultura, se sobrepusieron al preexistente sustrato de cultura local, caracterizado por una fase de proto-domesticación de la vid [7].

Antes del empleo de las variedades hermafroditas cultivadas, los racimos silvestres constituyeron la materia prima del vino. Probablemente el hombre, durante milenios, llevó a cabo un proceso de frutalización con el fin de aumentar la presencia de este recurso natural en sus alrededores en detrimento del uso de la vid silvestre. Con el desarrollo y aumento de las comunicaciones, la acción humana ha ido progresivamente destruyendo los hábitats de esta planta trepadora de forma directa o indirecta, mediante obras públicas (embalses, puentes, trazado de carreteras), expansión de las zonas agrcolas y explotaciones forestales, as como con la limpieza de las cunetas de las carreteras [7], por lo cual a da de hoy sólo quedan algunos reductos de poblaciones en la Pennsula Ibérica, Itálica, Helénica, Anatolia y región Transcaucásica. Arnold et al. [8] concluyen, además, que la vid silvestre en Europa está más afectada que en otros lugares del Mundo debido a que quedan muy pocos refugios para la misma y la tasa de supervivencia es muy baja, pues los intentos de recuperarla mediante trasplantes y reforestación suponen un elevado coste económico y con sin éxito. As, todo ese creciente impacto ambiental negativo ha llevado a la vid silvestre a figurar como especie amenazada en la lista roja publicada por la Unión Internacional para la Conservación de la Naturaleza (IUCN, 1997) [9].

En la Pennsula Ibérica, los hábitats que albergan todava un mayor número de parras silvestres son los bosques de ribera (Sierra Norte de Sevilla, Huelva y Parque Nacional de Doñana), ya que las parras son hidrófilas y toman árboles y arbustos como tutor, dado su carácter heliófilo. Los principales tutores corresponden a diversas especies de los géneros: Acer, Alnus, Crataegus, Ficus, Fraxinus, Olea, Populus, Quercus, Retama, Rubus, Ulmus, Rubus, entre otros. Asimismo, aparecen en diversas zonas coluviales de clima húmedo, como es el caso de la costa cantábrica. Hay refugios de vid silvestre en el Norte y en el Sur de la Pennsula Ibérica. La supervivencia de esta subespecie se ve también expuesta a las actividades agrcolas, aves (especialmente alcedinos) y otros factores humanos, además de la filoxera [7]. Según Böhm [10], la vid silvestre que alberga la Pennsula Ibérica también presenta particularidades genéticas diferentes a otras de su misma especie en otras regiones de la cuenca Mediterránea. Este autor denomina a las vides presentes en la pennsula Ibérica (España y Portugal) como vides del “polo ibérico” y a las presentes en la pennsula Itálica como vides del “polo talo-etrusco”. En Italia se distribuyen por diferentes regiones siendo las principales Piemonte, Lombarda, Cerdeña, Calabria, Basilicata y Sicilia [11].

Aparte de los usos tradicionales citados, la vid silvestre constituye un importante recurso fitogenético que alberga una importantsima diversidad fitogenética, con la que hay que contar para futuros programas de mejora de vinferas y portainjertos, as como para la reforestación de ecosistemas naturales. Actualmente, mediante marcadores moleculares, se abordan estudios sobre la contribución genética de las vides silvestres a las variedades de cultivo caractersticas de algunos puntos de la región Mediterránea. Sin embargo, bajo nuestro conocimiento, aún no existen estudios que determinen la ecologa de microorganismos asociados a la uva de vides silvestres, siendo de especial relevancia aquellos microorganismos implicados en la fermentación vnica y maloláctica, levaduras, bacterias lácticas o bacterias productoras de vinagre (bacterias acéticas). Por ello, pensamos que preservar la vid salvaje y su consecuente biodiversidad de especies microbianas es de enorme importancia no solo por su interés actual para la industria enológica y vinagrera tan importante en los pases del Mediterráneo as como en otros del Mundo, sino también para asegurar la conservación de un pool de genes de gran importancia tecnológica para la industria alimentaria en general y mantener estos recursos genéticos microbianos ante la inminente amenaza de extinción de la vid silvestre y crear nuevos estilos de vinos y vinagres que coloquen a España e Italia de nuevo a la cabeza en innovación enológica. En este sentido se hacen necesarios estudios que ayuden a cubrir ese “vaco de conocimiento”. La extinción de las pocas poblaciones de vid silvestre en Europa supondra una pérdida irreversible de la biodiversidad, no sólo de la propia liana que nos ocupa, sino también los microorganismos asociados a la misma. El objetivo fundamental evaluar la biodiversidad de microorganismos de interés biotecnológico asociadas a la uva de vides silvestres y proveer datos que refuercen la importancia de la protección de Vitis vinifera ssp. Sylvestris (Gmelin) Hegi “ in situ”. Además de aportar nuevas cepas de levaduras capaces de hacer frente a problemas comunes entre pases dónde la vitivinicultura es una importante fuente económica y social.

2 Material y métodos

La recogida uvas de vid silvestre se llevó a cabo en diferentes muestreos por triplicado en las diferentes regiones de estudio (Tabla 1) durante los meses de Septiembre, Octubre y Noviembre (según latitud y maduración de la uva) en el periodo del 2015 al 2017 la experiencia nos indica que en sistemas abiertos (campo) es importante hacer el muestro a larga escala (mnimo 2 años) para minimizar la influencia de las condiciones climáticas que afectan a las poblaciones de microorganismos presentes en la vid silvestre. Se emplearon bolsas asépticas para la recogida de bayas de uvas como muestra la metodologa descrita por Cordero- Bueso et al. (2011). Se realizó un estudio ampelográfico para determinar que las uvas recogidas perteneca a V. vinifera ssp . Sylvestris (Gmelin) Hegi siguiendo el protocolo de la O.I.V. También se llevaron a cabo fermentaciones a pequeña escala para aislar microorganismos al inicio, mitad y final del proceso fermentativo tal como se propone en Cordero-Bueso et al. [12]. Además, se aislaron los microorganismos directamente del hollejo de las uvas mediante lavados con cloruro sódico al 0,9% y con la ayuda de un sonicador y mediante rotura de las células vegetales por criogenización y con la ayuda de un bistur para aislar levaduras endofticas.

El aislamiento se realizó siguiendo protocolos de Microbiologa Clásica. Los medios de cultivo utilizados fueron: medio YPD (2% glucosa, 2% peptona, 1% extracto de levadura, 2% agar) y medio WL-agar (Oxoid). Para su conservación y posteriores estudios de identificación y caracterización se utilizaron los siguientes métodos de conservación: a) en placas Petri, conservándose a 4 °C y b) en glicerinados (glicerol 40%), conservadas a –80 °C [12].

La identificación de los aislados se hizo mediante la obtención de los diferentes perfiles moleculares del ADN total y mitocondrial previamente extrado mediante protocolos estándares. Las cepas aisladas se identificaron por las técnicas de biologa molecular PCR de la región ITS del ADN ribosómico y RFLP utilizando las endonucleasas de restricción HaeIII, HinfI y CfoI [12].

En el caso de las levaduras identificadas como Saccharomyces cerevisiae, se aplicó la técnica del análisis de los microsatélites multiplex o SSR con el objetivo de encontrar distintos perfiles a nivel de cepa [12]. Los amplificados se sometieron a electroforesis en geles de agarosa o en secuenciador automático. Y el análisis de las imagenénes en una cámara equipada con un transiluminador UV (BioRad). Se seleccionaron aquéllas que presentaron un perfil distinto y se tomaron al menos dos representantes de la misma especie para ser secuenciadas.

La secuenciación se llevó a cabo a través de los servicios de secuenciación MACROGEN Inc. Korea (http://www.macrogen.com). La alineación de sencuencias se realizó con programas de bioinformática online (CLUSTAL W, In-sillico, etc.). Las secuencias fueron comprobadas y depositadas en bases de datos electrónicas de colecciones de microorganismos (CECT, GenBank, NBCI, etc.).

Una vez bien identificados mediante las técnicas señaladas anteriormente, los microorganismos con diferentes perfiles moleculares fueron sometidos caracterización mediante pruebas bioqumicas y fsico- qumicas para conocer su capacidad de asimilación y fermentación de azúcares, resistencia al etanol y temperatura (curvas de crecimiento en lector de microplaca y fenotipo en placa medio-agar), al anhdrido sulfuroso, stress osmótico (curvas de crecimiento en lector de microplacas) y capacidad enzimática, se atenderá especialmente a las actividades glucosidasa, esterasa, proteasa y pectinasa (uso de kits enzimáticos y medios de cultivos especficos), ya que son de interés en la enologa por aportar complejidad a los vinos. Se siguieron protocolos similares a los descritos en Rodrguez et al. [13]. También se obtuvieron las curvas de crecimiento de las cepas de levaduras de géneros Saccharomyces y con propiedades enológicas de interés mediante el uso un lector de placas multipocillos (96 pocillos) en mosto estéril natural obtenido a partir de vides silvestres, mosto obtenido de la variedad tempranillo, mosto sintético y en medio YPD como control durante 72 horas a 28 °C y obteniendo medidas de lectura de concentración de células por mililitro a una Densidad Óptica de 600 nm e inoculando a un O.D = 0,2–0,4. Una vez recogidos los datos se trataron en Excel para obtener las curvas de crecimiento y se ajustaron de acuerdo al modelo de de cinética de Gompertz descrito por Buchanan et al. [14]. Estas curvas de crecimiento nos proporcionaron información para determinar el momento exacto (horas de crecimiento) de la fase exponencial de estas cepas y conocer el comportamiento en mosto natural de V. vinifiera ssp. Sylvestris al que están adaptadas, de este modo conoceremos el momento óptimo de inoculación de las cepas posteriores experimentos de fermentación.

Los datos obtenidos en todos los objetivos se analizaron a través de XSTAT. Además, se usaron programas especficos para los análisis filogenético (PAUP v4b10 y Modeltest 3.06), análisis Bayesianos (MRBA-YES v3.0b4), análisis de parsimonia heurstica y árboles filogenéticos (MAXTREES, PAUP v4b10).

3 Resultados y discusión

El número de cepas muestreadas durante el periodo 2013–2016 asciende a 29 puntos de muestreo (2 en Azerbaijan, 9 en Georgia, 10 en Italia, 1 en Rumana y 7 en España) en los cuales al menos se tomaron muestras de uva de entre 3 y 5 cepas de vid silvestre. La cantidad de uvas recolectadas fue variable, entre 100 g y 2,5 kg. El grado de maduración de la uva siempre fue óptimo para poder llevar a cabo microvinificaciones como método de autoenriquecimiento con objeto de aislar el número máximo de especies. De todas la muestras tomadas y analizadas se obtuvo un total de 3180 colonias de las cuales, una vez identificadas mediante los métodos moleculares mencionados en la sección de Materiales y Métodos se identificó un total de 50 especies pertenecientes a 10 géneros. La Tabla 2 muestra la frecuencia y distribución de las especies identificadas en la región Euroasiática. Entre los aislados, 5 cepas no fueron identificadas mediante los métodos moleculares conocidos hasta ahora, no obstante fueron caracterizados mediante técnicas clásicas de microscopa y a través de pruebas bioqumicas de fermentación y asimilación de azúcares (datos no mostrados). Adicionalemente, se aislaron levaduras viables pero no cultivables e igualmemente fueron caracterizadas siguiendo los procedimientos mencionados anteriormente. La especie mayoritaria aislada fue Saccharomyces cerevisiae, esto es debido al procedimiento experimental empleado de autoenriquecimiento, no obstante, esta especie también fue aislada directamente del hollejo de las uvas recolectadas, aunque en una baja proporción. Todos los aislados pertenecientes al género Saccharomyces fueron sometidos a posteriores análisis especficos para obtener diferentes perfiles a nivel de cepa (genotipos). Respecto a levaduras de géneros No- Saccharomyces, las especies Hanseniaspora uvarum y Pichia kluyvery fueron las especies mayoritarias, pero no se aislaron en todas las regiones muestreadas (Tabla 2). Algunas especies fueron exclusivas de cada área, como por ejemplo Aureobasidium proteae que solamente fue aislada en Italia, al igual que sucede con especies de los géneros Cryptococcus, Curvibasidium y algunas de Hanseniaspora. Las especies Clavispora lusitaniae, Hanseniaspora meyeri, Issatchenkia terricola y Xanthophyllomyces dendrorhou solo se aislaron en Georgia, al igual que sucede con Saccharomycodes ludwigii en Azerbayán. Rumana solo mostró una especie exclusiva entre los aislados, Pichia fermentans. En el caso de España cabe descatar que fue la región donde más especies diferentes se aislaron, podra venir motivado por haber muestreado un año más que en el resto de pases, sin embargo, también se identificaron numerosas especies no aisladas en otras áreas del Mediterráneo tales como Candida ethanolica, Candida sake, Candida stellata, Candida zemplinina, Lachancea thermotolerans, Meyerozyma caribbica, Pichia kudriavzevii, Rhodosporidium palidugenum, Rhodotorula glutinis, Scheffersomyces stipitis, Schwanniomyces polymorphus, Torulaspora delbrueckii y Wickerhamomyces anomalus. Pese a que ninguna de las especies identificadas en los diferentes pases donde se realizó el muestreo aparece en todos los pases, a excepción de Saccharomyces cerevisiae, cabe destacar que la especie Pichia manshurica fue aislada en Italia y España pero a la misma latitud (Monte Fenera y Tui).

Aquellos aislados que fueron identificados como pertenecientes al género Saccharomyces, dado el interés que suscita en la industria enológica, fueron posteriormente sometidos análisis de PCR Multiplex de microsatélites. Entre los aislados de S. cerevisiae se obtuvieron un total de 169 genotipos diferentes, siendo 80 de España, 56 de Georgia, 24 de Italia, 6 de Azerbaijan y 3 de Rumana. Se observó cierta relación entre los genotipos de todas la regiones pero sólo para algunos alelos. A continuación se explican los resultados obtenidos.

En la Fig. 1 se muestra el de mapa de calor obtenido a partir del análisis genómico (en base al tamaño en pares de bases del amplificado) por PCR multiplex de microsatélites con las tres parejas de primers. Los alelos se agrupan en filas y las cepas en columnas. Si se observamos individualmente los alelos y las cepas según su origen (Azerbayán, Georgia, Italia, Rumana y España) vemos claramente que los se dividen en tres grupos que corresponden a los tres genes amplificados.

Figure 1. Mapa de calor (Heatmap) de los diferentes genotipos obtenidos mediante PCR-Multiplex de Microsatélites en los diferentes pases de la región Euroasiática muestreados.

Según el cluster de la izquierda (dendrograma) se observa que las diferentes cepas de S. cerevisiae aisladas de uvas y microvinificaciones de uvas silvestres recogidas en las 5 áreas estudiadas se agrupan de acuerdo al tamaño de los alelos amplificados.

Si nos centrarnos en los patrones rectángulo/cuadrado dentro del mapa, los rectángulos grandes verdes de la izquierda muestran que para los alelos (YOR267) tenemos una coincidencia relativamente alta entre las cepas aisladas en los diferentes pases, fijándonos en la parte central del mapa se muestra un rectángulo rojo grande que aúna coincidencias entre los alelos (SC8132) de los diferentes pases, pero con una menor frecuencia que en el primer patrón y además se alejan bastante los aislados en Azerbayán (restángulo marrón oscuro) del resto de pases. En el caso del tercer patrón de colores más oscuros (marrón-negro) es completamente inverso, en comparación con los dos anteriores, as como el rectándulo verde intenso correspondiente a algunos genotipos aislados en Georgia demuestran la variabilidad y exclusividad de algunos genotipos al área Caucásica. Curiosamente se observa que algunos genotipos encontrados en España comparten varios alelos con aquéllos de los pases caucásicos (cuadros verdes, negro y rojo del de la parte inferior del mapa de calor) agrupados en un cuarto cluster (dendrograma de la izquierda). Con estos resultados se podra afirmar que existen tres regiones, áreas o ejes definidos en cuanto a genotipos de levaduras, seran el eje oriental (Azerbaijan y Georgia), el eje central (Rumana e Italia) y el eje occidental (España, pese a que comparte algunos genotipos con el eje oriental).

4 Conclusiones

Este estudio destaca el potencial de biodiversidad de entornos prstinos que aún representan una fuente fascinante para enfrentar problemas comunes en la elaboración del vino. Se están llevando a cabo estudios de evaluación del potencial biotecnológico de las diferentes especies aisladas, as como estudios para determinar si las cepas no identificadas son posibles nuevas especies.

References

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	Figure 1. Mapa de calor (Heatmap) de los diferentes genotipos obtenidos mediante PCR-Multiplex de Microsatélites en los diferentes pases de la región Euroasiática muestreados.